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刘梦葭, 杨粟, 程凯莹, 王梁燕, 华跃进. 奇球菌属的最新研究进展及其应用[J].核农学报, 2017,31(9): 1723-1729
LIU Mengjia, YANG Su, CHENG Kaiying, WANG Liangyan, HUA Yuejin. Research Progress of Deinococcus and Its Application [J].JOURNAL OF NUCLEAR AGRICULTURAL SCIENCES,2017,31(9): 1723-1729  
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奇球菌属的最新研究进展及其应用
刘梦葭, 杨粟, 程凯莹, 王梁燕, 华跃进*
浙江大学原子核农业科学研究所/农业部核农学重点实验室,浙江 杭州 310029
通讯作者:*通讯作者:华跃进,男,教授,主要从事DNA损伤修复与分子调控研究。 E-mail:yjhua@zju.edu.cn

作者简介:刘梦葭,女,主要从事耐辐射奇球菌的抗性机理研究。E-mail:374567935@qq.com

收稿日期:2016-09-09 接受日期:2016-12-09 网络出版日期:2017-09-10
基金:国家重点基础研究发展计划(2015CB910600),国家自然科学基金(31210103904,31370102,31570058 )
摘要

奇球菌属( Deinococcus)是迄今为止发现的最具抗辐射能力的一类细菌,在环境治理上具有巨大的应用前景,其中的耐辐射奇球菌( Deinococcus radiodurans)还是研究DNA损伤修复和极端抗性应激机制的模式生物。本文介绍了奇球菌属最新的研究进展,对奇球菌属生理结构特点和抗性机制进行了讨论,并对其在生物技术上的应用前景进行了展望,以期为后续研究者们快速了解该属细菌及其在生产上的应用提供支撑。

关键词: 奇球菌; 抗性机制; DNA损伤修复; 环境治理
文章编号:1000-8551(2017)09-1723-07 DOI:10.11869/j.issn.100-8551.2017.09.1723
Research Progress of Deinococcus and Its Application
LIU Mengjia, YANG Su, CHENG Kaiying, WANG Liangyan, HUA Yuejin*
Key Laboratory of Chinese Ministry of Agriculture for Nuclear-agricultural Sciences/ Institute of Nuclear-agricultural Sciences,Zhejiang University, Hangzhou, Zhejiang 310029
Abstract

All known members of the genus Deinococcus have strong radioresistance and great application prospect in environmental managements. Deinococcus radiodurans is the typical species of this genus and its mechanism of DNA damage repair and extreme stress resistance was studied very well. This paper summarized recent progress in the study of Deinococcus including physiology and mechanisms of radioresistance among its members, and the prospect of the application of these members in biotechnology, which may help researchers studying this new genus and its applications in production in the future.

Keyword: Deinococcus; mechanisms of radioresistance; DNA damage repair; environmental governance

奇球菌属(Deinococcus)对电离辐射、干燥、紫外线、丝裂霉素和强氧化剂等极端胁迫均表现出极强的抗性。目前, 多种不同的奇球菌属细菌被发现存在于各种不同的生态环境中, 从空气中的灰尘[1, 2]、沙漠的土壤[3]、被砷污染的水[4]、极地[5]到造纸过程中的表面生物膜[6]。该属细菌根据种类的不同, 能适应从4℃到55℃之间的生长温度, 具有对各种极端环境的非凡抵抗能力。与奇球菌属亲缘关系非常相近的嗜热菌属(Thermus)虽然能生活在90℃以上的高温环境中, 但其既不能形成多拷贝的基因组, 也不具有很强的抗紫外和辐射的能力[6]。因此, 研究生物的抗辐射机制以及更好地将其中的研究成果应用于生产和环境治理, 奇球菌属有着不可取代的研究价值和应用前景。

目前对暴露于辐射下的生物个体的保护引起了人们越来越多的关注。除此之外, 电离辐射虽然在疾病的预防与诊断治疗中发挥着一定的作用, 但是过量的电离辐射会对正常细胞造成伤害, 使其在医疗上的应用受到限制。不同细胞对辐照的抵抗能力不同, 一般来说, 脊椎动物对辐照损伤的敏感性要大于其他动物。10 Gy强度的辐照就会威胁到人类的生存, 而细菌可以忍受高达100 Gy的辐照, 耐辐射奇球菌却在1 500 Gy的辐照下仍然可以完全存活下来[7]。作为奇球菌属里抗辐射机制研究最透彻的一个种类, 它不仅有着独特而强大的DNA修复功能, 使得在受辐照后能迅速修复受损DNA片段, 还有其他的保护机制, 能保护辐照胁迫下细胞内的蛋白质、脂质等大分子[8]。本文通过对耐辐射奇球菌抗性机制最新研究进展进行综述, 以期在生化层面上展示奇球菌属细菌对各种环境胁迫的适应性并揭示它们在生产上潜在的应用价值。

1 奇球菌属简介

耐辐射奇球菌(Deinococcum radiodurans, DR)是奇球菌里研究得最透彻的成员, 于1956年由美国科学家 Anderson等[9]从辐射灭菌后变质的肉类罐头中分离而得, 直径在1.5~3.5 μ m之间。大部分细菌通过革兰氏染色可以简单地划分为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。然而奇球菌属细菌具有独特的细胞壁结构, 如耐辐射奇球菌的细胞壁成分和一般的革兰氏阴性细菌相似, 但是由于其肽聚糖层比较厚, 难以脱色, 因此实际革兰氏染色呈阳性。耐辐射奇球菌呈四联体状, 表面无鞭毛, 不能运动, 不产芽孢, 其菌落光滑、凸起、呈红色, 是具呼吸代谢的化能异养菌。在其他奇球菌中, 只有中度嗜热菌(Deinococcus geothermalis)呈短杆状, 其余均是球状菌[10]。中度嗜热菌的最适生存温度高达50℃, 并且其生长不需依赖于从外界获得氨基酸和烟酰胺[11]。

耐辐射奇球菌的整个基因组由4个环状分子组成: 染色体 I (2 648 638 bp)、染色体 II (412 348 bp)、一个大质粒 (177 466 bp)和一个小质粒 (45 704 bp), 总共3.28 Mb[12, 13, 14]。研究发现, 耐辐射奇球菌在生长缓慢的时候至少有4倍基因组, 而在快速生长时基因组的拷贝数甚至可以达到10倍[12], 这使得它们对DNA损伤有很高的耐受力。耐辐射奇球菌的基因组包含3 187个开放阅读框(open reading frame, ORF), 与公开数据库中蛋白序列相匹配的有2 185个, 仅占69%, 而剩下的1 002个ORF在数据库中并未搜索到匹配蛋白。

耐辐射奇球菌有许多遍布基因组的重复序列, 如SRE、SMR1、SMR2、SMR4、SMR5、SMR7、SMR8、SMR9 等, 这些重复序列有利于保证基因间、染色体间及质粒间重组修复的忠实性。还含有很多转座子(insertion sequences, ISs), 如IS2621、IS4、TCL121、TCL9、 IS3、IS200dr、AR-like等[13]。胁迫导致的转座子活动被认为是一个潜在的进化因素, 其使得细菌能够很好地适应各种严峻的环境。研究表明, 在耐辐射奇球菌中, 受到辐照后转座子ISDra2活动的频率上升50倍以上[15]。这可能也是耐辐射奇球菌具有极强适应力的一个原因。此外, 该细菌基因组不仅含有编码Nudix蛋白家族、Lon蛋白家族、Clp蛋白家族、NRAMP蛋白家族的基因, 而且包含众多与DNA修复相关的特异性基因, 如pprI、pprA、pprM系列及编码DNA损伤响应蛋白的基因(ddrA-ddrP)等[13, 16]。

奇球菌属中Deinococcus gobiensis含有6.69 Mb的基因组, 而Deinococcus proteolyticus含有最少的基因组 (2.84 Mb), 差异之大在细菌中非常罕见(研究最多的埃希氏菌属基因组的大小在4.5~5.8 Mb之间)[17, 18]。基因组大小的差异表明奇球菌属各成员在基因水平上具有多样性, 意味着它们有较强的基因组适应性, 使得奇球菌具有很强的抗氧化、抗电离辐射、抗干燥、抗丝裂霉素等能力[19]。

2 奇球菌属的抗性机制

奇球菌对电离辐射、紫外线、干燥等逆境都具有很强的抗性。现有研究认为, 其主要原因归于以下几个方面:1)特殊而更高效的DNA损伤修复机制; 2)酶类及非酶类抗氧化系统; 3)具有高效的胞内清洁系统[8]。此外, 奇球菌属的转化效率极高, 使其在进化上具有极强的适应性[20]。

2.1 特殊而更高效的DNA修复机制

过量暴露于干燥或辐射下会导致细胞产生DNA单链或双链的断裂(double-strand breaks, DSBs), 甚至产生大量短DNA片段。染色体的断裂是随机产生的, 因此在每条染色体上造成的遗传信息缺失也是随机的。一般情况下, 一个细胞内同源染色体之间出现断裂的部位是不同的, 因此, 理论上通过介导染色体间碎片重排, 断裂的染色体能够被修复完整。然而对于奇球菌属细菌来说, 面对至少4套基因组形成的DNA碎片, 在重建染色体的同时还要避免无效的同源性搜索, DNA损伤修复所需工作量很大。有研究表明, 与对辐射敏感的细菌相比, 奇球菌在经过辐射后基因组所受到的损伤没有显著的差异, 这说明奇球菌属更多拷贝的基因组并不能降低其辐射胁迫后DNA损伤的概率[21]。因此该属细菌要在有限的时间内完成全基因组的修复工作, 必然有着特殊而高效的DNA修复能力, 这也是其辐照和干燥抗性的基础。

耐辐射奇球菌的DNA受到损伤后, 主要涉及以下几种DNA修复机制:1)染色体间SSA途径; 2)特殊的ESDSA途径; 3)特有的同源重组方式。首先, 在受到辐射等胁迫后, 细胞内的染色体会断裂为DNA小片段, 小片段直接依靠碱基配对原则形成一系列带有5'或3'粘性末端的配对的小分子DNA。接着, 这些DNA可以依靠粘性末端通过不同染色体间的重组连接成长链(染色体间SSA途径), 进而依靠核酸酶补充缝隙, 但这种途径效率相对较低。或者带有粘性末端的小分子DNA也可以通过特殊的延伸合成依赖性链退火(extended synthesis-dependent strand annealing, ESDSA)途径, 粘性末端可以作为引物, 利用重叠的同源片段为模板, 形成移动的D-环(D-loop), 进一步形成更长的延伸DNA单链, 然后通过合成形成完整的双链线状DNA。最后, 该线状DNA通过依赖RecA酶的同源重组, 末端转向连接成环状DNA。有研究认为, 耐辐射奇球菌在产生大量DSBs后优先选择ESDSA途径进行修复, 这种途径需要至少2个基因组拷贝和随机断裂的DNA片段, 并依赖于DNA聚合酶Ⅰ 和RecA, 最大可能的合成互补DNA链。同源重组一般出现在DNA修复后期, RecA结合在双链DNA上, 然后在ATP的催化下, 形成长链螺旋状DNA, 精确地将连续的DNA片段连接起来成为长线性双链DNA, 其过程还需要单链结合蛋白SSB、RecD、DNA聚合酶Ⅰ 、RecR、RecO、RecQ、RecJ等的参与[22, 23, 24]。最近, 浙江大学原子核农业科学研究所华跃进教授实验室解析了RecJ蛋白的晶体结构, 并进一步揭示了RecJ、SSB、RecQ三者如何参与RecFOR对DNA的末端切割[25]。

在奇球菌属中存在一类特有的DNA损伤反应(DNA damage response, DDR)蛋白, 在DNA损伤保护和修复中起着重要作用, 其功能正被逐渐发现, 如DdrB蛋白能结合ssDNA, 并与SSB蛋白互作且具有促进单链退火功能。在细胞内ssDNA比dsDNA脆弱, 容易受核酸酶的降解, 所以DdrB蛋白的单链退火功能使其对ssDNA具保护功能[26]。同时, DdrB蛋白参与RecA非依赖型DNA修复途径, 且最近研究发现DdrB可以促进SSA途径, 使小片段DNA能够快速而准确地形成以适用于后续的ESDSA途径[27]。另一种特殊的蛋白称之为PprI(也叫IrrE), 是一个调控开关, 可以在细菌受胁迫之后在Mn2+的作用下, 与DdrO作用, 使DdrO从结合的DDR基因上脱离, 促进RecA和其他一些DNA修复蛋白的表达, 从而增强细胞的抗性。PprI对耐辐射奇球菌的电离辐射、紫外辐射和丝裂霉素等抗性都至关重要, 其缺失会导致胁迫后耐辐射奇球菌中RecA表达量的极显著下降[28, 29, 30]。

奇球菌属中的小RNA (small non-coding sRNA, sRNA)也参与DNA损伤修复过程。sRNA在辐照处理后受到损伤的概率显著低于大分子的DNA受到损伤的概率, 因此研究者认为sRNA介导的DNA损伤修复调控过程更具有稳定性[8]。研究表明耐辐射奇球菌有一部分sRNA在受到辐射后表达量明显上升。推测这些sRNA能够结合在辐射抗性相关蛋白(RecA、RuvA、RadA)的mRNA上。耐辐射奇球菌中很多sRNA在同属其他种类中存在同源物, 如耐辐射奇球菌在受到辐照后表达上调的8个sRNA中有7个存在于中性嗜热菌中。最新研究发现耐辐射奇球菌内的Dsr2在经过辐照处理后表达量下降, 并且Dsr2表达的下调会使recA表达量上升, 从而影响DNA修复过程[31]。还有研究表明, 一些sRNA在耐辐射奇球菌受到辐射刺激后, 几乎立刻就在细胞内起作用[32]。

2.2 酶类及非酶类抗氧化系统

辐射、干燥等极端环境容易使细胞产生活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS), 如羟基自由基(OH· )、超氧游离基 (O2· ̄)和过氧化氢(H2O2)。80%的DNA损伤是由活性氧自由基造成的, 奇球菌的抗氧化系统主要包括酶类清除剂(如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、类胡萝卜素), 非酶类的清除剂(如锰离子复合物等)。

奇球菌含有丰富的抗氧化酶, 如耐辐射奇球菌有3个过氧化氢酶KatE(DR1998)、KatA(DRA0259) 和 KatB(DRA0146); 4个超氧化物歧化酶Mn-SOD (DR1279), Cu/Zn-SOD (DR1546、DRA0202和DR0644); 1个细胞色素 C 过氧化物酶 (DRA0301); 1个铁依赖的过氧化物酶(DRA0145)[33]。其中KatE活性可达到大肠杆菌的15倍, 是其细胞内主要的过氧化氢酶[34]。耐辐射奇球菌编码的这些蛋白能大量消耗细胞内的ROS, 从而保护蛋白免受氧化损伤。

类胡萝卜素是生物体内常见的一种细胞色素, 在非光合作用生物内常被用做消除细胞代谢产生的ROS的一类重要物质。很多奇球菌属呈现红色、橙色、黄色等是由于它们含有大量的类胡萝卜素, 这些类胡萝卜素可能与该类细菌抗辐射能力有关。研究表明, 敲除耐辐射奇球菌的crtB、crtI基因会使该菌呈现无色, 缺失crtB、crtI的突变株对H2O2胁迫的敏感性比野生菌株高了100倍左右, 对电离辐射、紫外线等的胁迫也更加敏感, 但对丝裂霉素的敏感性未增加[35]。这可能是由于耐辐射奇球菌对DNA损伤的保护机制很大程度上是基于其强大的清除氧自由基的能力, 类胡萝卜素在此过程中起了极为关键的作用[36]。浙江大学原子核农业科学研究所华跃进教授实验室研究表明, 在奇球菌属中, 耐辐射奇球菌和Deinococcus radiopugnans的类胡萝卜素提取物表现出了最强的抗氧化作用[37]。

小分子也参与到奇球菌属的抗氧化作用中。二价锰离子(Mn2+)可以和磷酸、碳酸氢盐或氨基酸形成复合体去除H2O2, 减少自由基的产生[38]。Dps(DNA-binding protein from starved cells)蛋白Dps1(DR2263)和Dps2(DRB0092)可以螯合Fe2+并结合DNA使之不被氧化损伤[39]。2010年, Daly等[40]发现耐辐射奇球菌细胞破碎并超滤后的上清可以有效地保护大肠杆菌全蛋白被氧化。经鉴定该上清中含有丰富的小分子, 包括 Mn2+、磷酸根(phosphate)、尿苷(uridine)、腺苷(adenosine)、尿嘧啶 (uracil)、氨基酸(amino acids)和多肽片段(peptides)等, 这些小分子的加入可以有效地保护细菌甚至人类细胞中的蛋白氧化损伤。进一步的研究发现, 耐辐射奇球菌中对电离辐射抗性强的细胞比对电离辐射敏感的细胞胞内聚集了更多的Mn2+、Fe3+, 它们对细胞内蛋白质的保护起了重要作用[40]。细胞在辐射条件下对蛋白质的保护能力, 尤其是对与DNA修复相关蛋白的保护, 直接关系到该细胞能否从辐射所造成的损伤中恢复过来[41]。由此Daly[21]提出, 耐辐射奇球菌的细胞受到胁迫后, 细胞能否生存更多地取决于其蛋白受到损害的程度而不是DNA受到损害的程度。

浙江大学原子核农业科学研究所华跃进教授实验室研究还发现, 耐辐射奇球菌胞外环境中的dGMP可以有效增强其抗氧化能力。当唯一的分泌型核酸酶(DRB0067)失活后, 体外环境中的DNA很难被降解成 dGMP, 菌体抗氧化能力大大下降。推测可能是体外的dGMP转运进体内后可以用来合成第二信使cGMP, 有利于菌体对氧化压力做出快速响应。因此, 胞外的DNA可能不仅能被细胞重新吸收利用, 而且还能防止细胞突变[42]。

2.3 具有高效的胞内清洁系统

耐辐射奇球菌胞内拥有较为完善的自净系统(cleansingsystem), 能够高效的把DNA、蛋白质碎片转运到细胞外。损伤的DNA主要先由 Nudix家族成员 MutT 蛋白水解, 再由核苷酸酶(nucleotidase)水解, 最后由ABC 转运蛋白(UvrA2)转运到胞外[13]。而耐辐射奇球菌胞内损伤的蛋白质, 由蛋白酶消化成氨基酸得以重新合成蛋白, 这些蛋白酶通常能在损伤剂作用下被激活[34]。

3 奇球菌属的应用

奇球菌属作为一类对各种胁迫耐受力极强的细菌, 研究其相关生化和分子机理并投入到应用中具有重要的意义。目前, 奇球菌属细菌抗性相关的一些理论研究成果越来越多的被应用于环境治理、提高其他物种的抗性、食品工业的生产等方面。

3.1 改造菌株用于高辐射、重金属等背景的环境治理

奇球菌能吸收外来DNA, 且效率很高。基因工程经常需要染色体的修饰。染色体变异可能是由自然界随机产生的, 发生在容易发生插入、删减、修饰的特定位置。Brim等[43]将大肠杆菌中抗水银(Hg)的基因(merA)导入耐辐射奇球菌中, 得到的菌株可以很好的生存在高辐射物高Hg含量的环境中, 并能降低环境中辐射物Hg的含量, 有望被用于辐射污染地区的环境治理。

中度嗜热菌对干旱、辐射、重金属等各种环境压力具有很好的抵抗能力, 加上其耐热性使其在生产上有很高的应用价值。据报道, 在高温和大约50 Gy· h-1的条件下, 中度嗜热菌能够减少环境中Hg(Ⅱ )、三铁氨三乙酸、铀(VI)、铬(VI) 的含量, 在工业生产上有着独特的优势[44], 能有效降低工业废液中重金属的污染。

耐辐射奇球菌能大量吸附环境中的铀, 并在表面形成含铀片状结晶物[45]。覃贻琳等[46]采用固定化技术以海藻酸钠为固定化载体包埋活体耐辐射奇球菌和肖方竹等[47]研制出的新型功能化磁性耐辐射奇球菌吸附剂NFGDR都有望应用于含铀废水的治理, 降低水中铀的含量。

Brutesco等[48]用奇球菌属中Deinococcus deserti作为生物传感器检测水环境的重金属含量取得了成功, 这比大肠杆菌作为生物传感器的效率更高、更方便也更加经济。Kazuya等[49]将中度嗜热菌的NADH oxidase (Nox)基因成功在大肠杆菌内过表达, 为制作生物传感器奠定了基础。

3.2 特殊基因转入其它生物以提高其胁迫抗性

奇球菌属含有一些特殊的胁迫抗性调控基因, 将其导入其它生物可提高这些生物的某些特定抗性[50]。将耐辐射奇球菌的特有基因pprI转到其他细菌中可以提高这些细菌多方面的抗性。如将pprI基因转导入大肠杆菌, 其对乙醇、丁醇、醋酸的抗性可增强10倍~100倍[51]; 还可以提高其抗电离辐射和耐盐能力, 对电离辐射抗性可增强约1.6倍[52]。

pprI基因在真核细胞中也起作用, 它可以提高油菜(Brassica napus)的抗盐能力; 也能提高酵母和海拉细胞(Hela)细胞对电离辐射抗性的效果[53]。冯德玉等[54]将pprI基因转入油菜使油菜对133Cs 或88Sr胁迫抗性增强。浙江大学原子核农业科学研究所华跃进教授实验室也发现将耐辐射奇球菌的pprI基因导入乳酸菌中, 不但增强了乳酸菌对各种环境胁迫的抗性, 而且还能使其产生更多的乳酸[55]。pprI基因作为耐辐射球菌属特有的基因, 却在真核和原核生物中都能起作用, 表明奇球菌属细菌独特的基因具有不可估量的潜在应用价值。

3.3 奇球菌属的特殊代谢途径与生产

一般而言, 大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是微生物工程和生物技术应用的2种主要微生物。奇球菌属含有较为特别的降解和代谢多聚糖及酯类的途径, 使得其被应用于生物技术工程。近几年, 研究人员开始将奇球菌属应用于食品工业[6]。

耐辐射奇球菌含有较为特殊的β -类胡萝卜素, 具有很强的自由基清除和抗氧化作用, 能够有效保护蛋白免受氧化胁迫, 并且表现出抑制肿瘤细胞增殖等药理学活性, 具有潜在的应用价值[36]。目前对该类胡萝卜素在耐辐射奇球菌内的代谢途径已基本研究清楚, 使其投入生产也将成为可能。

一般生物有2种吸收和利用糖的途径:戊糖磷酸途径和糖酵解途径。中度嗜热菌在有氧条件下有优先通过戊糖磷酸途径代谢, 产生NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)。其中, 戊糖磷酸途径及其产生的NADPH直接参与抗氧化过程, 包括氨基酸、维生素、多醇、类异戊二烯和脂肪酸的合成[56]。目前微生物工程菌多用大肠杆菌和酿酒酵母, 产生的主要是NADH, 因此可将中度嗜热菌用于与NADPH相关的一系列代谢产物的生产应用。随着生物信息学的发展, 对微生物代谢的了解逐渐增多, 使得建立完整的生产链生产由糖而产生的一系列化合物成为可能。尽管目前在生产上大肠杆菌和酵母占据了绝大部分, 但它们并不能很好地满足生产需求, 中度嗜热菌能够吸收廉价碳源(有机废物、木纤维等), 从而更好的满足生产上的需要[6]。

4 总结与展望

奇球菌属是迄今为止所发现的细菌中辐射耐受性最强的一类细菌, 且具有生长力强、易培养、无致病性等优点, 这使得其成为极具开发和利用前景的微生物资源。目前越来越多的研究揭示了这类细菌顽强抗性的奥秘, 今后可利用其独特基因资源用于修复辐射污染环境、培育抗辐射抗干旱耐盐的新型农作物, 将其特色的代谢途径用于工业生产中的糖、酯类的开发和应用。对其辐射抗性在分子水平上的深入研究有利于更好地探究肿瘤细胞的发病机制, 并寻找抗辐射药物。随着未来对奇球菌属细菌的研究愈趋完善, 该类细菌更多的应用价值将会被发现和利用。

The authors have declared that no competing interests exist.

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