引用本文
周会明, 张焱珍, 张小雷, 柴红梅, 李晓君, 龙再峰, 尼玛. .1株巨大口蘑的鉴定及培养基中无机盐优化[J].核农学报, 2017,31(3): 524-531
ZHOU Huiming, ZHANG Yanzhen, ZHANG Xiaolei, CHAI Hongmei, LI Xiaojun, LONG Zaifeng, NI Ma. .Taxonomic Identification of Macrocybe gigantea and Optimization of Inorganic Salts in Its Media [J].JOURNAL OF NUCLEAR AGRICULTURAL SCIENCES,2017,31(3): 524-531  
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1株巨大口蘑的鉴定及培养基中无机盐优化
周会明1,2, 张焱珍1,2, 张小雷2, 柴红梅2,*, 李晓君1, 龙再峰2, 尼玛1
1滇西科技师范学院农学系,云南 临沧 677000
2云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,云南 昆明 650221
通讯作者:*柴红梅,女,研究员,主要从事大型真菌资源评价与利用研究。E-mail:chm621@aliyun.com

作者简介:周会明,男,讲师,主要从事食用驯化与栽培研究。E-mail:632243530@qq.com

收稿日期:2016-03-07 接受日期:2016-07-18 网络出版日期:2017-03-10
基金:国家食用菌产业技术体系(CARS-24),国家自然科学基金(31460014)
摘要

为筛选巨大口蘑菌丝生长的最优培养基,从采集自云南临沧的野生口蘑子实体中分离获得菌株YAASM4295,利用形态学与ITS序列分析的方法对其进行分类学鉴定;并以不同的无机盐为基础,通过单因素试验,各筛选出2种大量元素和微量元素,采用L9(34)正交试验设计,分析4种无机盐及其正交组合对该菌菌丝生长的影响。结果表明,采集到的菌株为巨大口蘑,供试无机盐对其菌丝生长在不同程度上均有促进作用,其中0.1 mg·mL-1 MgSO4、0.1 mg·mL-1 K2HPO4、0.05 mg·L-1CoCl2、0.05 mg·L-1MnCl2对该菌生长与生长势的促进作用最大,且与其它处理相比达到了极显著水平。4种无机盐协同作用对该菌菌丝生长影响的大小依次为MgSO4>CoCl2>MnCl2>K2HPO4;最佳组合为0.2 mg·mL-1 MgSO4+0.1 mg·mL-1 K2HPO4+0.01 mg·L-1 MnCl2+0.01 mg·L-1 CoCl2。综上,该野生巨大口蘑菌株在各无机盐培养基组合之间的菌丝生长速度差异极显著,不同组合间有明显的交互作用,这为其优质栽培提供了理论依据。

关键词: 野生巨大口蘑; 分离; 鉴定; 无机盐; 正交优化
文章编号:1000-8551(2017)03-0524-08 DOI:10.11869/j.issn.100-8551.2017.03.0524
Taxonomic Identification of Macrocybe gigantea and Optimization of Inorganic Salts in Its Media
ZHOU Huiming1,2, ZHANG Yanzhen1,2, ZHANG Xiaolei2, CHAI Hongmei2,*, LI Xiaojun1, LONG Zaifeng1, NI Ma1
1 The Department of Agronomy, Dianxi Science and Technology Normal University, Lincang, Yunnan 677000
2 Institute of Biotechnology and Germplasmic Resource, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming,Yunnan 650221
Abstract

The aim of this study was to screen the optimal medium for culturing Macrocybe gigantea. Strain YAASM4295 was isolated from a wild mushroom fruiting body of Tricholoma, from Lincang, Yunnan its taxonomic status was carried out by morphology and ITS sequence analysis. In this paper, the effects of macro-element and trace element on the growth of M. gigantea were screened by the L9(34) orthogonal design, which were the basis of exploring its single factor experiment. The result showed that the wild strain of YAASM4295 is M. gigantea, all the inorganic salts at different degree could promote the growth of the mycelia of M. gigantea. 0.1 mg·mL-1 MgSO4, 0.1 mg·mL-1 K2HPO4, 0.05 mg·L-1 CoCl2 and 0.05 mg·mL-1MnCl2 had the highest mycelial growth rate and vigor, and significantly stronger than the other treat. The cooperative effects of four inorganic salts on the mycelial was MgSO4>CoCl2> MnCl2> K2HPO4. The best combination for the mycelia growth of M. gigantea was 0.2 mg·mL-1 MgSO4+0.1 mg·mL-1 K2HPO4+0.01 mg·mL-1 MnCl2+0.01 mg·mL-1 CoCl2. In conclusion, the mycelial growth rate of wild M. gigantea strain YAASM4295 revealed that each combination has a highly significant difference and significant, which is the basis of its high quality cultivation.

Keyword: a; wild; Macrocybe; gigantea,; isolation,; identification,; inorganic; salts,; orthogonal; optimization

巨大口蘑 [Macrocybe gigantean(Massee)Pegler & Lodge(≡ Tricholoma giganteum Massee)]隶属于担子菌门(Basidiomycota)、伞菌亚纲(Agaricomycetidae)、伞菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomataceae)、巨大口蘑属(Macrocybe), 是1998年从口蘑属(Tricholoma)独立出来的新属[1]。目前共有7个种, 我国除巨大口蘑外还有洛巴伊大口蘑(M. lobayensis), 该属已得到分子和形态学支持[2, 3, 4, 5, 6]。巨大口蘑是一种食药兼用的大型真菌, 具有子实体肥大、形美、易保存等优点, 具有抗氧化[7]、抗真菌[8]、抗高血压[9]等极高的药用价值和营养价值[10], 在热带地区商业化生产该菌具有重要的经济前景。

目前, 国内外有关研究人员已对巨大口蘑的菌丝体培养[11, 12]、栽培[13, 14]、酶活[15]、营养成分[16]、遗传多样性[17]等方面进行了研究。但该菌的商业化生产范围受限且规模小, 许多地区仍然处于试验栽培阶段, 严重制约该菌的大规模推广[18, 19]。此外, 食用菌生长发育的营养因素很多, 无机盐是其重要因素之一, 其中Mg2+、Cu2+、Mn2+等元素对其生长发育尤为重要[20, 21, 22]。

本试验从采集自云南临沧的野生巨大口蘑子实体中分离获得YAASM4295, 结合形态学特征与ITS序列的方法鉴定其分类学地位, 并以不同浓度的大量元素与微量元素单因素试验为基础, 从中各筛选出2种最适大量元素与微量元素, 利用正交试验探索4种无机盐对巨大口蘑菌丝生长的最优培养基组合, 旨在为该菌的优质栽培提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料

供试巨大口蘑菌株YAASM4295, 由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所鉴定并提供。

基础培养基:葡萄糖 20 g, 蛋白胨 2 g, 琼脂 15 g, 超纯水定容至1 L, 自然pH。

YPD固体培养基:葡萄糖 20 g, 蛋白胨 2 g, 酵母提取粉2 g, 琼脂 15 g, 水定容至1 L, 自然pH。

YPD液体培养基:葡萄糖 2 g, 蛋白胨 2 g, 酵母提取粉2 g, 水定容至1 L, 自然 pH。

大量元素(分析纯):Na2MoO4, KCl, Na2SO4, CaCO3, KNO3, NaCl, MgSO4, K2HPO4, Ca(NO3)2。

微量元素(分析纯):ZnSO4, CoCl2, MnCl2, ZnCl2。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的采集、分离纯化及培养 2013年8月4日, 在云南省临沧市云县一块玉米地上采集到1株野生口蘑, 对其子实体的菌盖颜色、菌盖大小、菌柄长度等进行测定。具体操作方法为:采用食用菌常规组织分离法, 取健壮且幼嫩子实体1朵, 用无菌水清洗, 并用75%酒精表面消毒, 在超净工作台(SW-CJ-2F, 苏州安泰空气技术有限公司)上, 取1块菌盖与菌柄交界部位的菌肉接种于YPD固体培养基上, 25℃下培养5 d后将得到的纯菌丝体转入斜面培养基中, 并编号为YAASM4295, 备用[23]。

1.2.2 ITS序列测定及系统发育树构建 接少量菌丝体于5 mL YPD液体培养基中, 25℃恒温静止培养2周。过滤收集菌丝体, 取1g 菌丝体置于2 mL离心管中, 液氮冷冻条件下研磨至粉末状, 使用CTAB法[24]抽提DNA, 然后用0.8%琼脂糖在EPS301电脉仪(北京市六一仪器厂)上检测DNA的质量和浓度。选用ITS4(5'-T C C T C C G C T T A T T G A T A T GG-3')和ITS5(5'-G G A A G T A A A A G T C G T A A C A A GG-3')通用引物对PCR扩增ITS片段。50 μ L反应体系包括:2× Power Taq PCR MasterMix 25 μ L(北京百泰克生物技术有限公司), 10 μ mol· L-1引物各2.5 μ L, DNA模板1 μ L, 无菌去离子水补足50 μ L。扩增在C1000TM Thermal Cycler PCR扩增仪(美国BIO-RAD公司)上进行, 扩增程序如下:94℃预变性5 min; 94℃变性30 s, 57℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 35个循环; 72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 符合预测的样品进行双向测序。本试验所用引物的合成及PCR产物序列测定均在上海生物技术有限公司完成。将所测得的ITS序列提交到GenBank核酸序列数据库, 并通过NCBI在线BLAST N检索, 与GenBank中的ITS基因序列进行同源性比较。

1.2.3 单因素试验 在基础培养基中分别加入上述大量元素与微量元素, 每一种大量元素设6种浓度(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0和15.0 mg· mL-1), 每一种微量元素设6种浓度(0.01、0.05、0.10、0.50、1.00和1.50 mg· L-1), 每一种浓度设3次重复, 以基础培养基中不加任何无机盐为对照。封口, 121℃灭菌30 min, 灭菌后趁热倒入直径90 mm的平板, 在无菌操作下, 将直径为5 mm事先活化并用打孔器处理过的菌饼接入平板中央, 置于22℃ HWS-250恒温箱(上海森信实验仪器有限公司)内培养10 d。十字交叉法测量菌丝生长量(mm· d-1), 记录菌种菌丝生长势, 其中以“ +++” 表示浓密健壮, “ ++” 表示较浓密, “ +” 表示生长, “ -” 表示不生长[25]。

1.2.4 正交试验 以无机盐MgSO4、K2HPO4、MnCl2、CoCl2为处理因素, 共设3个水平, 采用L9 (34)正交试验, 试验因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平 Table 1 Factors and level of orthogonal experiment/(mg· L-1)
1.3 数据分析

试验数据均经SPSS 19.0软件进行统计分析, 所得基因序列利用ClustalX软件对其进行多序列联配分析, 并用MEGA4.0软件中的最大似然法(ML)构建系统进化树和计算遗传距离[26]。

2 结果与分析
2.1 菌株YAASM4295的生物学鉴定

2.2.1 野生巨大口蘑子实体形态特征 子实体生长于玉米地, 其形态特征为:丛生, 大型, 初期半球形, 后期平展, 表面光滑、干燥, 中央为下凹, 污白色, 菌盖直径5.0~10.0 cm, 边缘平滑、易裂, 成熟后内卷。菌肉白色, 厚实、坚韧, 嫩、清脆、有浓厚的蘑菇香味且略带有淀粉味。菌褶污白色, 宽, 不等长, 直生或弯生, 稍密。孢子印白色, 担孢子光滑、椭圆形。菌柄中生, 长17.0~30.0 cm, 粗5.5~12.0 cm, 同菌盖色, 后期比盖颜色深, 内实, 表面光滑且有细线条, 基部肥大略弯曲, 无菌环与菌托(图1)。菌丝体在不同培养基上长势不同, 白色, 绒毛状, 有锁状联合。综上, 根据菌株的形态学特征, 并参考《中国大型真菌》[27], 菌株YAASM4295与巨大口蘑相似。

图1 野生巨大口蘑子实体Fig.1 The fruiting bodies of a wild Macrocybe gigantea

2.2.2 基于ITS序列的系统发育分析 将获得的正反向序列使用DNAStar软件包中的SeqMan进行拼接、编辑, 获得完整的ITS序列(序列长度626 bp), 通过NCBI在线BLAST N检索, 该序列与GenBank中报道的巨大口蘑(M. gigantea)JN006792.1、JX041888.1、JX068526.1等基因序列有90%的相似性。以口蘑属的2个种为外群, 利用ClustalX软件对所得序列进行多序列联配分析, 并用MEGA4.0软件构建系统进化树, 计算遗传距离(图2)。结合其形态学特征和系统发育分析, 最终鉴定YAASM4295菌株为巨大口蘑(M. gigantea)。

图2 基于ITS序列的巨大口蘑与最大似然法系统发育分析(1 000次重复)Fig.2 Maxium likelihood phylogenetic analysis(1 000 repeats)of Macrocybe gigantea and other Macrocybe species based on their ITS sequences

2.2 单因素试验

2.2.1 大量元素对巨大口蘑菌丝生长的影响 由表2可知, 从菌丝生长速度方面分析, 9种大量元素试验组对巨大口蘑的影响均大于对照组(1.70± 0.20 mm· d-1), 大小顺序依次为K2HPO4> MgSO4> NaCl> KCl> 其它> 对照, 但只有上述4种大量元素化合物在不同浓度下其菌丝生长势与对照组(菌丝生长势为“ +++” )相同, 其中Na2MoO4、KCl、Na2SO4、CaCO3、KNO3、NaCl、MgSO4、K2HPO4、Ca(NO3)2分别在浓度为0.1、0.1、0.5、0.5~1.0、5.0、0.1、0.1、0.1、0.5 mg· mL-1时生长最快, 且与其它处理相比均达到显著水平(P< 0.05)。而K2HPO4、MgSO4浓度为0.1 mg· mL-1时, 其菌丝生长最快且长势好(图3), 且与其它处理达到极显著水平(P< 0.01), 这2种大量元素化合物在节约经济, 对该菌的生长发育的影响方面均符合筛选标准。

表2 大量元素对巨大口蘑菌丝生长的影响 Table 2 Effects of macroelementon mycelial growth of Macrocybe gigantea/(mm· d-1)

2.2.2 微量元素对巨大口蘑菌丝生长的影响 由表3可知, 在菌丝生长速度方面, 4种微量元素试验组对巨大口蘑的影响均大于对照组(2.36± 0.13 mm· d-1), 大小顺序依次为CoCl2> MnCl2> ZnCl2> ZnSO4> 对照, 其中CoCl2、MnCl2、ZnCl2、ZnSO4均在浓度为0.05 mg· L-1时生长最快, 且与其它处理相比在不同程度上均达到显著水平(P< 0.05)。而CoCl2、MnCl2在浓度为0.05 mg· L-1时, 其菌丝生长最快且长势与对照组菌丝相同, 与其它处理也达到了显著水平(P< 0.05)(图3), 这2种微量元素化合物在节约经济以及对该菌生长发育影响等方面均符合筛选标准。

图3 4种无机盐对巨大口蘑菌丝生长的影响Fig.3 Effects of of four inorganic salts on the mycelia growth of Macrocybe gigantea

表3 微量元素对巨大口蘑菌丝生长的影响 Table 3 Effects of trace elementon mycelial growth of Macrocybe gigantea/(mm· d-1)
2.3 正交试验

由表4可知, 不同的无机盐及其正交组合对巨大口蘑菌丝生长的影响不同。各列极差大小顺序为RA> RC> RD> RB, 即试验因素的主次顺序为:A> C> D> B, 最优组合为A3B2C1D1, 但通过该组合得到的菌丝生长速度为2.99± 0.06 mm· d-1, 菌丝生长势为“ +++” , 优于正交试验得到菌丝生长的最适组合A3B2C1D3(2.88± 0.25 mm· d-1, 菌丝生长势为“ +++” )。由表5可知, 正交组合的P=0.001< 0.01, 表明各组合之间的菌丝生长速度差异达到极显著水平, 说明不同组合有明显的交互作用, 最终确定A3B2C1D1为试验最优组合, 即最佳组合为:0.2 mg· mL-1 MgSO4、0.1 mg· mL-1 K2HPO4、0.01 mg· L-1 MnCl2、0.01 mg· L-1 CoCl2。

表4 正交试验结果 Table 4 The results of orthogonal test
表5 方差分析 Table 5 Analysis of variance
3 讨论

目前, 一些食用菌的鉴定主要依靠形态学, 由于没有很好的分子特征支持, 导致其种群的分类给研究人员造成诸多不便与误导, 如茶树菇(Agrocybe aegerita)[28]。rDNA ITS序列因具有进化速率较快、片段长度适中、在基因组不同重复单元间十分一致的特点, 成为应用于真菌属内种间及种群系统学研究较理想的核基因标记方法[29, 30, 31]。本研究在形态学的基础上, 获得菌株YAASM4295的ITS序列, 结合GenBank已有的口蘑属真菌的基因序列特征, 最终确定该菌株为巨大口蘑, 为后期相关研究奠定了基础。

在不同的浓度下, 各种无机盐对食用菌的生长发育具有重要的影响, 高浓度无机盐不利于甚至抑制高等真菌菌丝的生长[32], 本研究在巨大口蘑中也得到了相似的结果。研究表明, 巨大口蘑子实体中含极其丰富的大量元素(K、Mg、Na等), 而微量元素含量极少, 尤其是Mn、Fe、Zn等元素[33]。因此, 该菌菌丝生长对大量元素的需求量大于微量元素, 本研究也得到相同结果。在单因素试验中, 0.1 mg· mL-1 MgSO4对该菌生长与生长势的促进作用最佳, 该结果进一步论证了黎金锋等[34]发现在0.5 mg· mL-1单一浓度试验下, 该无机盐对巨大口蘑有促进作用的结论, 但刘鸿高等[11]的试验结果表明, 在普通PDA培养基上添加0.05%的MgSO4(相当于0.5 mg· mL-1)对巨大口蘑菌丝表现出抑制作用, 与本研究中0.5 mg· mL-1 MgSO4对该菌具有促进作用的结果相反, 这可能与菌株的多样性、基础培养基的成分、试验操作误差、药品厂家等有关。微量元素在食用菌生长发育过程中需要量较少, 但其作用是不可相互代替的, 本研究发现0.05 mg· L-1CoCl2、0.05 mg· L-1MnCl2对巨大口蘑菌丝生长发育均有不同程度的促进作用, 该结果可填充Mn和Co元素针对该菌菌丝体研究的空白, 为进一步研究其生理代谢奠定基础。

然而试验还发现, 正交试验结果与单因素试验中的各无机盐最佳浓度存在差异, 在MgSO4、K2HPO4、CoCl2及MnCl2同时存在情况下, 同等浓度下MgSO4的作用被削弱, 而CoCl2、MnCl2的作用增强, 这种交互作用结果在其它真菌中也同样发生[35]。这可能是由酶促反应活性引起的, 各种反应均有稳定的酶促最大活化作用, 即酶的活化剂需求总量不变, 当其种类增加, 单个活化剂的需求量反而减少; 若活化剂的含量增加, 活性调节剂需求量则减少。反之, 其需求量随着活化剂含量的减少而增加。综上, 在巨大口蘑的商品化推广过程中, 因不同生境菌株的遗传特性、适应性、营养代谢类型、子实体活性成分含量等存在差异, 以不同无机盐、不同浓度对该菌的敏感性研究为基础, 可以参考食用菌的多样性[36]、培养基成分[37]、子实体加工与营养[38]等方面的研究成果, 针对该菌自身特性进行创新与深入的探究, 最终实现高产、优质的栽培目标。

4 结论

根据形态特征与系统发育树, 菌株YAASM4295被鉴定为巨大口蘑。单因素试验证明, 供试的13种无机盐Na2MoO4、KCl、Na2SO4、CaCO3、KNO3、NaCl、MgSO4、K2HPO4、Ca(NO3)2、CoCl2、MnCl2、ZnCl2、ZnSO4对该菌菌丝生长有不同的影响, 其中高浓度无机盐有抑制作用。0.2 mg· mL-1 MgSO4, 0.1 mg· mL-1 K2HPO4, 0.01 mg· L-1 MnCl2, 0.01 mg· L-1 CoCl2是最佳组合, 无机盐对该菌菌丝生长影响的大小依次为MgSO4> CoCl2> MnCl2> K2HPO4。本研究结果既实现了对本地野生巨大口蘑资源的开发与保护, 又为该珍稀菌株的生长发育筛选了最适无机盐培养基, 为其优质栽培提供了理论依据。

The authors have declared that no competing interests exist.

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