试验所用材料为中棉35号棉花(Gossypium hirsutum L.), 由山西省农业科学院棉花研究所提供。Pure Link􀳏 Plant RNA Reagent (TRIzol)购自美国Invitrogen公司; 反转录试剂盒和RT-qPCR试剂盒等均购自北京全式金公司; 引物合成由北京三博远志生物技术有限公司完成。

1.2.1 引物序列设计 由于miRNA片段较短且没有poly(A)尾巴, 不能按常规方法进行反转录和PCR扩增, 因此设计茎环特异性反转录引物对miRNA进行特异性反转录(图1)。在miRNA 数据库miRbase (http://www.mirbase.org/)中下载miR156(登录号:MI0005638)、miR159(登录号:MIMAT0000177)、miR5658(登录号:MI0019242)的序列, 然后设计3条引物:一条茎环特异性反转录引物(stem-loop primer)用于RT-PCR, 一条正向引物(forward primer)用于PCR扩增, 一条通用反向引物(universal reverse primer)用于半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)。在每个茎环特异性反转录引物的内部都设计一段固定的序列, 且能形成一个茎环结构, 其5'端共有44个固定核苷酸序列(5'-G T C G T A T C C A G T G C A G G G T C C G A G G T A T T C G C A C T G G A T A C G AC-3'), 在固定核苷酸序列的5'端(5'-G T C G T A T C C A G T GC-3')和3'端(5'-G C A C T G G A T A C G AC-3')反向互补构成长14 bp的茎结构, 余下的16 nt构成茎环引物的环结构; 在茎环引物3'端设计6 nt与miRNA的3'端反向互补。正向引物长约17~24 nt, 在3'端有13~18 nt与miRNA的5'端互补。在正向引物的5'端加4~6 nt保护碱基, 使退火温度控制在60℃左右。通用的反向引物长16 nt, 位于茎环引物5'端的第11~第26位碱基上, 引物序列见表1。

1.2.2 TRIzol法提取总RNA 称取棉花的组织样品100 mg, 用液氮研磨至粉末状, 根据Pure Link􀳏 Plant RNA Reagent的使用说明, 采用TRIzol 法提取总RNA。加入10~30 μ L RNase-free Water溶解总RNA, 总RNA样品用1.5%琼脂糖电泳检测RNA完整性, NanoDrop ND-2000 分光光度计(NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)测定RNA的浓度。

1.2.3 Stem-loop RT-PCR 试验使用反转录试剂盒合成cDNA。具体操作:于冰上配制反应体系(20 μ L), 加入1 μ L stem-loop primer(1 μ mol· L^-1)、RNase-free Water和RNA(1 μ g), 将混合物短暂离心, 65℃金属浴5 min, 冰浴2 min。加入2× TS Reaction Mix (10 μ L), TransScript􀳏 RT/RI Enzyme Mix (1 μ L), gDNA Remover (1 μ L), 轻轻混均, 短暂离心。采用脉冲逆转录反应进行cDNA第一链的合成, 具体程序如下:首先16℃孵育30 min, 然后进行60个循环的脉冲反应(每个循环:30℃ 30s, 42℃ 30s, 50℃ 30s), 最后反应液进行85℃ 5s灭活反转录酶。反转录得到的cDNA分装-20℃贮存在, 将反转录后的cDNA稀释10倍后使用。U6基因使用随机引物(random primer)反转录, 25℃孵育10 min, 42℃孵育30 min, 最后反应液进行85℃ 5s灭活反转录酶。为了检测Stem-loop RT-PCR的灵敏度, 对RNA按10倍梯度稀释, 终浓度分别是2 pg、20 pg、200 pg、2 ng、20 ng、200 ng, 进行逆转录反应, 合成cDNA后备用。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 miRNA引物和序列 Table 1 The miRNA sequences and primers 引物 Primers 序列 Sequences miR156-F 5'- CGGCGGTGACAGAAGAGAGT-3' miR156-R 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGTGCTC-3' miR159-F 5'-CCGCGCTTTGGATTGAAGGGA-3' miR159-R 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAGAGC-3' miR5658-F 5'-CCGCGCATGATGATGATGATG-3' miR5658-R 5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTCAT-3' U6-F 5'-GCACTTTATTGGTCCATCATCC-3' U6-R 5'-GACACCTGGCTCTTTTTGATTC-3' 通用反向引物 Universal reverse primer 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'

表1 miRNA引物和序列 Table 1 The miRNA sequences and primers

1.2.4 半定量 RT-PCR以反转录后稀释10倍的cDNA为模板, 加入相应引物(表1)进行半定量RT-PCR反应。于冰上配制反应体系(20 μ L):10× PCR buffer (2 μ L)、dNTP Mixture (0.4 μ L)、forward primer (0.4 μ L)、universal reverse primer (0.4 μ L)、cDNA (2.0 μ L)、Easy Taq(0.1 μ L)、ddH₂O (14.7 μ L); PCR程序:94℃预变性2 min, 进行35个循环扩增, 94℃变性15 s, 58℃退火和延伸1 min, 4℃保存, 使用4%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.2.5 RT-qPCR 试验使用全式金提供的反应试剂盒(TransStart Top Green qPCR SuperMix Kit)、于冰上避光配制反应体系(20 μ L):qPCR SuperMix (10 μ L)、forward primer (0.4 μ L)、universal reverse primer (0.4 μ L)、ddH₂O(6.2 μ L)。轻轻混均, 短暂离心。将 18 μ L 不含cDNA模板的混合物加入RT-qPCR专用96孔板中, 然后每孔加入稀释10倍的cDNA 2 μ L。RT-qPCR程序:95℃预变性5 min, 45个循环, 95℃变性 5 s, 60℃退火10 s, 72℃延伸1 s。熔解曲线程序:从65℃加热至95℃, 每秒升高0.5℃, 确定扩增产物的特异性。每个样品作3次重复, U6作为内参基因(NCBI登录号:XM_016853274), 2^{-△ △ Ct}法^[33]计算相对表达量。

1.2.6 扩增效率的计算 以10倍梯度稀释的cDNA模板, 进行RT-qPCR分析。以稀释倍数为横坐标, Ct值为纵坐标制作标准曲线。通过公式E=(10^(-1/s)-1)× 100%计算引物的扩增效率, 其中S为标准曲线斜率^[33]。

分析棉花miRNA表达量时, 对其总RNA质量存在着较高的要求, 因此, 首先对TRIzol试剂提取的棉花总RNA质量进行分析。由图2可知, 总RNA经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测, 28s rRNA和18s rRNA条带亮度清晰, 没有拖带、杂带, 表明提取的总RNA的完整性较好; 棉花样品的总RNA浓度在500~950 ng· μ L^-1, OD₂₆₀/OD₂₈₀值在1.9~2.1之间, 说明提取的棉花总RNA质量较好, 能够保证后续试验的进行。

图2

Fig.2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 棉花总RNA琼脂糖凝胶电泳图 注:R:根; S:茎; L:叶。Fig.2 Agarose gel electrophoresis photo of cotton total RNA Note: R: Root. S: Stem. L: Leaf.

为了评价Stem-loop RT-PCR在棉花中应用, 必须先对设计的引物扩增效率进行检验。先利用茎环特异性反转录引物将RNA反转录成cDNA, 对cDNA进行10倍梯度的稀释, 进行RT-qPCR。对获得的Ct值和稀释梯度进行相关性分析。由图3可知, miR156和miR159扩增的Ct值和稀释梯度成显著正相关关系, 相关系数R²均为0.999, 其回归方程的斜率分别为S_miR156=3.27和S_miR159=3.24, 由此计算出miR156 和miR159的PCR扩增效率分别为102.0%和103.6%。结果表明, 在10^-4~10梯度稀释cDNA的拷贝数范围内引物扩增效率高。此外, RT-qPCR产物的融解曲线, 在82℃左右出现单一峰, 无杂峰, 进一步证明了引物具有良好的特异性(图4)。总之, 本研究设计的茎环特异性反转录引物、正向引物、通用反向引物可以用于棉花中miRNA的PCR检测分析, 能准确地反映模板中miRNA的相对表达量。

图3

Fig.3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 miR156、miR159引物扩增标准曲线Fig.3 Standard curve graph of amplification of miR156 and miR159 with the specific primers

图4

Fig.4

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图4 miR156和miR159引物融解曲线Fig.4 Melt curve graph for SYBR GreenⅠ of miR156 and miR159 with the specific primers

在使用Northern blot分析miRNA表达量时, 一般需要2 μ g植物RNA^[22]。为确立Stem-loop RT-PCR方法的检测灵敏度, 将提取的棉花叶组织的总RNA作一系列梯度稀释, miR156和miR159在茎环特异性反转录引物特异性反转录后, 直接进行半定量RT-PCR分析。结果表明, Stem-loop RT-PCR扩增35个循环能检测到2 pg的棉花总RNA中的miR159, 而对于棉花miR156表达量的检测, 则至少需要20 ng的总RNA, 且扩增循环数在35个以上(图5)。同时, 在没有加茎环特异性反转录引物反转录的cDNA中没有扩增出特异条带(数据略)。此外, 所有扩增反应中均未发现引物二聚体, 也说明Stem-loop RT-PCR方法在棉花miRNA表达量分析具有较高的特异性。

图5

Fig.5

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图5 Stem-loop RT-PCR扩增miR156和miR159的灵敏度分析 注:上方数字代表RNA反转录的量, 右边数字代表PCR的循环数。M: DNA ladder, 2条带大小分别为250 bp和100 bp。Fig.5 The sensitivity analyses of miR156 and miR159 contents by Stem-loop RT-PCR Note: The amounts of RNA used for reverse transcription reactions are indicated on the top. PCR cycle numbers are indicated on the right. M: DNA ladder including 250 bp and 100 bp.

为了进一步确定Stem-loop RT-PCR在棉花miRNA表达量检测中的高效性, 选择表达量高的Gh-miR156, Gh-miR159和表达量低的Gh-miR5658进行组织特异性分析。结果表明, Stem-loop RT-PCR方法可以有效地检测3个miRNA在棉花根、茎、叶中的表达量。由图6可知, Gh-miR159在棉花的根、茎、叶中丰度最高, Gh-miR156在棉花的根、茎、叶中丰度也比较高, 而Gh-miR5658在根、茎、叶中的丰度相对很低。同时, 这3个miRNA在根茎叶中的表达量存在明显差异, 暗示它们可能在不同的组织中有特异的功能。这些结果进一步说明, Stem-loop RT-PCR方法适用于棉花不同表达量的miRNA定量分析。本研究建立的Stem-loop RT-PCR具有灵敏度高、特异性强、成本较低、操作流程简单等优点, 可以普遍地应用在棉花miRNA表达量检测。

图6

Fig.6

Figure Option ViewDownloadNew Window

图6 Gh-miR156、Gh-miR159和Gh-miR5658在棉花中的表达谱 注:叶表达水平设置为“ 1” , 数据通过t检验分析, 误差线为标准误, * 和* * 分别代表在0.05和0.001水平上差异显著。Fig.6 Expression profiling of Gh-miR156, Gh-miR159 and Gh-miR5658 in cotton Note: Expression levels of leaf was normalized to ‘ 1’ . Means with SD were statistically analyzed, and significant differences were determined by Student’ s t-test. * and * * indicted significant difference at 0.05 and 0.001 levels, respectively.